Novo orodje za učinkovito potrjevanje natančnosti reakcij CRISPR-Cas9

DRŽAVNI SVET: Na 38. izredni seji DS dva veta (Julij 2019).

Anonim

Priljubljenost CRISPR-Cas9 še naprej narašča že od prve uporabe pri urejanju genomov januarja 2013. Kaj naredi CRISPR-Cas9 tako neverjetno je njegova presenetljiva učinkovitost in razpoložljivost; razmeroma gledano, je enostaven za uporabo. Lansko leto so znanstveniki Centra za genome inženiring pri Inštitutu za osnovno znanost (IBS) objavili članek v celični celici celic, ki opisuje, kako so popravili obrnjeno gensko sekvenco, ki je učinkovito pozdravila vrsto hemofilije. Skupina Jin-Soo Kim v IBS je tudi uporabila CRISPR-Cas9 za izvedbo postopka brez uporabe tujih DNA za spreminjanje poljščin. To je tako neverjetno uporabno orodje in ima v prihodnosti toliko potenciala, da je bila v središču mednarodnega vrha o urejanju človeških genov v Washingtonu decembra 2015. Prihodnost aplikacij CRISPR omejena je le domišljija znanstvenikov, ki uporabljajo to.

CRISPR-Cas9 je izjemno orodje, vendar tehnologija ni popolna. Ko se uporablja, včasih povzroči vstavke in brisanje, znane kot indeles, na nenamernih spletnih mestih, ki niso ciljno usmerjene. Ker nenamerno cepitev genov lahko povzroči nepričakovano mutacijo, je ključnega pomena zaznati morebitne napake v procesu CRISPR-Cas9. 19. januarja v raziskavi Genome Research je ekipa Kim v IBS predstavila orodje, ki so ga poimenovali multipleks Digenome-seq (digested sequencing of genoms), ki lahko istočasno razporedi genome široke specifike več CRISPR-Cas9 nukleaze, da najde tako namerne kot nezaželene hitro in poceni.

Prvi avtor Daesik Kim pojasnjuje, da se "Digenome-seq razlikuje od drugih celičnih metod, saj zazna cepitve DNA in vitro, ne pa v celicah, z uporabo genomske DNA brez celic". Prednost uporabe celične DNK je, da daje natančne rezultate analize, ker kromatin, ki ga običajno najdemo v celici, ne ovira postopka. Tudi zato, ker se zadevne DNK ne razmnožujejo enako z uporabo PCR pred preiskavo; Digenome-seq je lažji, hitrejši in cenejši za uporabo kot prejšnje metode. Digenome-seq deluje tako, da združuje brez celične tarče DNK s proteinom Cas9 in sgRNA (enojni vodnik RNA) in vitro. SgRNA vodi Cas9 na ciljno in off-ciljno mesto na DNA, kjer ga cepi endonukleaza Cas9. V študiji so raziskovalci identificirali kraje, ki so bili odtegnjeni v in vitro, in izmerili indel frekvence na več sto zunaj ciljnih mest v celicah, ki bi lahko postale nenamerne mutacije. Njihova natančnost se nato doseže z uporabo sistema, ki ga je razvila skupina IBS, imenovana OTI (indeks efektivnega učinka), ki primerja razmerje med ciljnim in ciljnim frekvencam.

Za razliko od predhodno uporabljenih procesov monopleksa, ki lahko delujejo samo z eno sgRNA hkrati, multiplex Digenome-seq izvaja hkratno analizo številnih sgRNA, da hkrati odkrije vse svoje ciljne in off-ciljne strani. Ta multipleksni postopek je hitrejši, učinkovitejši in stroškovno učinkovitejši od prejšnjih metod. Digenome-seq poleg svoje hitrosti lahko zazna več indikatorjev zunaj tarče kot druge metode, kot sta HTGTS ali Guide-seq. Direktor IBS-ja Jin-Soo Kim je dejal, da je "CRISPR-Cas9 neverjeten znanstveni preboj in bo še naprej raziskovalno središče biologov po vsem svetu." Dodal je, da "se ta tehnika lahko uporabi za izbiro ciljnih lokacij z najmanj ciljnimi učinki, ki so bistveni za terapevtske aplikacije CRISPR-Cas9." Z vrhunsko natančnostjo, prihrankom stroškov in hitrostjo se zdi, da je multiflex Digenome-Seq nov standard za testiranje specifičnosti CRISPR-Cas9.

menu
menu